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CRISPR 文库筛选:鉴定新型肿瘤靶标的强大工具

癌症是一种基因关联的疾病。随着时间的推移,基因突变在细胞内不断积累,最终驱动了细胞的恶性转化以及肿瘤细胞的增殖。随着人类对癌症发生过程的不断深入了解,研究人员正在不遗余力地开发技术平台以便系统化地鉴定不同癌细胞生存所必需的基因。然而,癌细胞对必需基因的依赖性会随着所处环境变化而变化,这就需要有办法模拟人体内及暴露于治疗药物时肿瘤所面临的选择压力,并在此压力下筛选潜在的药物靶标。CRISPR文库筛选则正好可以满足这一需求。

 

 

大量的癌症研究越来越清晰地揭示,随着培养条件的变化,癌细胞也在狡猾地改变自己,依赖不同的必需基因来存活。譬如,在体外以3D球体形态生长的癌细胞主要依赖一组必需基因存活;如果细胞在培养皿中进行2D 培养,癌细胞则会“投靠”另外一组必需基因而存活。此外,其他研究已经表明,将癌细胞经由药物处理或与细胞毒性T细胞共培养会改变其必需基因列表。类似的,癌细胞在免疫缺陷动物和免疫正常动物体内移植产生的异体移植肿瘤,它们所依赖的必需基因也会不一样。

 

这些研究证明了外界筛选压力对癌细胞的影响;更重要的是,这提示了筛选压力会影响癌细胞对药物的应答。通过深入探讨不同筛选压力的作用,研究人员可以探索出新的、更精确的方法来杀死癌细胞,并更有针对性地克服癌细胞产生的耐药性。CRISPR文库筛选能为这项工作提供强有力的支撑。

 

为什么要使用 CRISPR 筛选

 

CRISPR/Cas9向导RNA(sgRNA)文库筛选解决了癌症药物开发中的一些重大挑战,并带来了新的机遇。例如,肿瘤最终会对现有的靶向疗法产生耐药性,导致患者病情复发并恶化。CRISPR文库筛选可以帮助阐明癌症产生耐药性的机制。

 

 

现在研究人员已经越来越普遍地利用CRISPR文库来探索肿瘤耐药机制。在药明康德的一个研发项目中,研究人员在体外将一个全基因组CRISPR 文库引入到一个对 pomalidomide 敏感的多发性骨髓瘤细胞系中,在处理IC90剂量的pomalidomide后收集多发性骨髓瘤细胞,并使用新一代测序(NGS) 进行分析,以探索潜在的耐药机制。

 

本研究提高了我们对多发性骨髓瘤患者获得长期良好预后的认知。大多数新诊断的多发性骨髓瘤患者最初对pomalidomide 和其他免疫调节药物有反应,但后来出现耐药和复发。该研究鉴定出了新的影响 Cereblon(pomalidomide的主要靶标)表达的调控基因,为防止多发性骨髓瘤细胞的耐药和复发提供了新的思路。

 

此外,研发人员时常发现药物在某些患者中的疗效不如预期,这就产生了对生物标志物的需求,生物标志物能够帮助识别潜在的应答者。另外,组合疗法已经成为癌症治疗的一种趋势,鉴定用于组合疗法的合成致死靶点也成为癌症药物研发的一大热点。同样地,CRISPR文库筛选可满足这两种需求。 

 

为了利用 CRISPR 文库筛选来识别致敏突变,研究人员在体外将全基因组敲除文库导入对细胞周期检查点抑制剂几乎不敏感的胰腺癌细胞系。用IC20剂量的抑制剂处理后,在两个不同的时间点收集细胞。在药物处理和未处理的细胞中比较sgRNA的富集和丢失,发现17个潜在的调节细胞周期进程的合成致死靶标,它们主要参与到胞质分裂和血红素生物合成。

 

合成致死靶点的识别为治疗对细胞周期检查点抑制剂耐药的胰腺癌患者提供了新方法。该工作同时也让针对细胞周期检查点的靶向药物重新焕发活力。 

 

这只是 CRISPR 文库筛选能够增进对癌症生物学理解的众多案例之一。定制化的CRISPR/Cas9文库的体内筛选为探索肿瘤免疫学治疗开启了新的方向。当癌细胞试图建立原发和继发病发灶的时候,它们也在不断积累遗传不稳定性和体细胞突变,以避免被宿主免疫系统清除。CRISPR文库可以帮助研究人员识别 T 细胞免疫的调节因子。

 

全基因组sgRNA文库不适用于体内筛选,因为在最初接种的细胞中每个sgRNA至少要500X的覆盖率。这一限制使得定制化CRISPR 文库有了用武之地。

 

通过使用定制化 CRISPR sgRNA文库,研究小组能够在体内识别使肿瘤对药物敏感的基因。在一个项目中,研究人员构建了一个有2000个sgRNA 靶向300个基因的文库。研究人员随后将该文库引入到一种小鼠癌细胞系,将细胞植入具有免疫活性的小鼠体内,并用小鼠 PD-1 抗体对小鼠进行治疗。

 

植入小鼠的的癌细胞生长成肿瘤,在肿瘤体积达到 1000 mm3 之前,研究人员从中收集癌细胞。对收集的肿瘤细胞进行NGS 分析,检测sgRNA 丰度的变化,包括sgRNA的丢失和富集。值得注意的是,该研究将一些基因的功能缺失与肿瘤对 PD-1 抗体的敏感性联系起来,从而提供了增加检查点抑制剂适用范围的新思路。肿瘤细胞的体内竞争实验进一步验证了CRISPR 筛选识别出的特定靶点。

 

如何运行 CRISPR 筛选

 

CRISPR筛选能够识别合成致死基因、耐药性驱动因子和其他靶点,这使得该技术成为肿瘤药物研发工具包的关键组成部分。然而,这需要专业的能力和丰富的经验,才能最大限度地利用这种方法。体外和体内CRISPR 筛选工作流程是由一系列步骤组成的,每一个步骤都必须精准地设计和执行,才能产生对癌症生物学的真正有意义的发现。  

 

sgRNA文库的设计是项目成功的基础。这一关键步骤包括选择可能发挥最佳作用的sgRNA。sgRNA编辑效率的波动意味着研究者需要依赖CRISPR文库筛选的丰富经验来为某个特定项目选择最佳的sgRNA。有效地进行文库的合成、实验操作和NGS数据分析同样需要丰富的经验和专业知识。

 

作为业内领先的新药研发服务平台,药明康德具备所需的丰富经验和专业知识。药明康德已经建立了一支由50多名博士和硕士科学家组成的专业CRISPR 团队,他们已经进行了数百次CRISPR 文库筛选。

 

药明康德经验的价值体现在其设计并选择定制sgRNA文库的方法上。药明康德基于公共数据库并通过使用Broad Institute 等机构创建的算法选择sgRNA。虽然这些资源是公开可用的,但药明康德长期积累的专业技能和经验则是不可多得的。在进行了数百次 CRISPR 文库筛选后,药明康德的科学家对sgRNA在实际实验中的表现有着丰富的一手经验。这些经验帮助我们更好地为特定的定制文库选择最佳的sgRNA。

 

药明康德在CRISPR文库筛选方面的研究提示在定制文库中引入非靶向sgRNA和非必需基因sgRNA作为阴性对照对于最终的数据分析是至关重要的。如有可能,引入阳性对照,例如已知参与研究过程的基因能够帮助校正数据分析法则并提升可信度。药明康德在CRISPR定制文库筛选中始终加入阴性和阳性对照,这大大提高了团队在实践中筛选出高可信度靶标的几率。

 

药明康德秉承精益求精的行为准则,不仅在sgRNA文库的设计上,而且在CRISPR筛选工作流程的其余环节(包括sgRNA合成,文库构建以及NGS数据分析)持续改进,不断完善。通过将这些不断打磨,迭代并提升的能力与其在靶点验证方面的专业知识相结合,药明康德正在全力以赴地帮助生物制药公司探索并开发癌症治疗方法,以满足尚未满足的医疗需求。